Blottning lag

Valet av alkaliska mot neutrala överföringsmetoder är emellertid ofta empiriskt och kan leda till motsvarande resultat. Tryck appliceras ständigt på gelen antingen med sug eller genom att placera en stapel pappershanddukar och en vikt ovanpå membranet och gelen för att säkerställa god och jämn kontakt mellan gelen och membranet. Vid överföring blottning lag sugning används SSC 20x-bufferten för att säkerställa tätning och förhindra torkning av gelen.

Överföring av bufferten genom kapillärverkan från ett område med hög vattenpotential till ett område med låg vattenförsörjning vanligtvis filterpapper och papperstyger används sedan för att överföra DNA från gelen till membranet; Jonbytesinteraktioner binder DNA till membranet på grund av den negativa laddningen av DNA och den positiva laddningen av membranet.

Fem metoder kan användas för att överföra DNA-fragment till ett fast membran, och de är: [8] uppåtgående kapilläröverföring: denna metod överför ett DNA-fragment uppåt från gelen till membranet, där flödet av vätska eller buffert kommer att vara uppåt. Kapilläröverföring nedåt: denna metod utförs genom att placera en gel på ytan av ett membran, vanligtvis ett nylonladdat membran, och DNA-fragment överförs nedåt med flödet av en alkalisk buffert.

Samtidig överföring till två membran: denna metod används för att överföra DNA-fragment med hög koncentration samtidigt från en gel till två membran. Elektroforetisk överföring: Denna metod använder vanligtvis en stor elektrisk ström, vilket gör det svårt att överföra DNA effektivt på grund av buffertens temperatur, så dessa maskiner kan utrustas med kylmaskiner eller användas i ett kallt område.

Vakuumöverföring: Denna metod använder en buffert från den övre kammaren för att överföra DNA från gelen till ett nitrocellulosa-eller nylonmembran, gelen placeras direkt på membranet och membranet placeras på en porös skärm på en vakuumkammare. Immobilisering: membranet bakas blottning lag i en vakuum eller konventionell ugn vid 80 XC i 2 timmar under standardförhållanden; nitrocellulosa eller nylonmembran eller exponeras för ett ultraviolett nylonmembran för att permanent fästa det överförda DNA: t på membranet.

Hybridisering: därefter utsätts hybridiseringssonden - ett separat fragment av DNA från en specifik sekvens, vars närvaro i mål-DNA måste fastställas-för membranet. Sondens DNA är märkt så att det kan detekteras, vanligtvis genom att aktivera radioaktivitet eller märka molekylen med ett fluorescerande eller kromogent färgämne. För att säkerställa specificiteten av sondens bindning till provets DNA, använder de vanligaste hybridiseringsmetoderna lax eller sill DNA-spermsond.

Upptäckt: Efter hybridisering tvättas överskottssonden ut ur membranet, vanligtvis med användning av en SSC-buffert, och hybridiseringsmönstret visualiseras på en röntgenfilm med autoradiografi i fallet med en radioaktiv eller fluorescerande sond, eller färgutveckling på membranet om en kromogen detektionsmetod används. Tolkning av resultaten [redigera] hybridisering av sonden med ett specifikt DNA-fragment på filtermembranet indikerar att detta fragment innehåller en DNA-sekvens som är komplementär till sonden.

DNA-överföringsstadiet från elektroforesgelen till membranet gör det enkelt att binda den märkta hybridiseringssonden till den fraktionerade DNA-storleken. Det möjliggör också fixering av målrörelsehybrider som krävs för analys med hjälp av autoradiografi eller andra detektionsmetoder. Södra blottar utförda med enzymrestriktion genomiskt DNA klyvt kan användas för att bestämma antalet e-sekvenser.

En sond som hybridiserar i endast ett segment av DNA som inte har skurits av ett restriktionsenzym kommer att producera en enda rand på den södra fläcken, medan flera ränder sannolikt kommer att observeras när sonden hybridiserar till flera mycket liknande e-sekvenser. Nylonmembranet är mer hållbart och har en högre bindningsförmåga till DNA-fragment än nitrocellulosamembranet, så DNA-fragment kommer att vara mer fästa vid membranet även när membranet inkuberas vid höga temperaturer.

Dessutom, jämfört med ett nitrocellulosamembran, som kräver hög jonstyrka för att binda DNA-fragment till membranet, använder nylonladdade membran buffertar med mycket låg jonstyrka för att överföra även små DNA-fragment på cirka 50 bp. DNA som ska överföras separeras av polyakrylamidgel. Vid blottningssteget är den mest effektiva metoden att överföra DNA från gelen till membranet vakuumöverföring, eftersom det överför DNA snabbare och kvantitativt.

Oligonukleotider är utformade på ett sådant sätt att de kompletterar målsekvensen.Oligonukleotider syntetiseras kemiskt, radioaktivt märks och används för att screena ett DNA-bibliotek eller andra samlingar av klonade DNA-fragment.

Sekvenser som hybridiserar med hybridiseringssonden analyseras ytterligare, till exempel för att erhålla den fullständiga sekvenslängden för målgenen. Normal kromosomal eller genomarrangemang kan studeras med hjälp av denna teknik. Det används också för att bestämma vilken igenkänningsplats som har ändrats på grund av en enda nukleotidpolymorfism som förändrar ett specifikt restriktionsenzym.

Särskilt användbara är de begränsade nukleaserna MSPI och HPAII, som båda känner igen och splittrar i samma sekvens. Efter blotting visualiseras de överförda molekylerna, till exempel genom färgfärgning, silverfärgning av proteiner, autoradiografisk visualisering av radioaktiva molekyler som utförs före blotting eller specifik märkning av vissa proteiner eller nukleinsyror.

Den senare utförs med användning av antikroppar eller hybridiseringssonder som endast binder till vissa blottingmolekyler och har ett anslutet enzym. Efter korrekt tvättning visualiseras denna enzymatiska aktivitet och följaktligen molekylerna som blottning lags i blott genom inkubation med rätt reagens, vilket gör antingen en färgavsättning på blott eller en kemiluminescerande reaktion, som registreras av fotografisk film.

Southern blotting kombinerar överföringen av elektrofores separerade av DNA-fragment till ett filtermembran och efterföljande detektion av fragment med hjälp av sondhybridisering. Proteinerna separeras först efter storlek med hjälp av elektrofores innan de överförs till en lämplig blottingmatris, vanligtvis polyvinylidenfluorid eller nitrocellulosa, och därefter detektion med antikroppar.

Far Western Blot [redigera] liknar Western blotting, far western blot använder proteininteraktioner-proteininteraktioner för att detektera närvaron av ett specifikt protein immobiliserat på blottingmatrisen. Antikropparna används blottning lag för att detektera närvaron av ett protein-proteinkomplex, vilket gör far western blot till ett specifikt fall av Western blotting. Southwest Blot [redigera] Southwest blot är baserad på den södra blot och används för att identifiera och karakterisera DNA-bindande proteiner genom deras förmåga att binda till specifika oligonukleotid sonder.

Oriental blot [redigera] den orientaliska blot används för att detektera specifika posttranslationella modifieringar av proteiner.